Генная и клеточная инженерия: рекомбинантные плазмиды, ПЦР-диагностика и клонирование

Генная инженерия — совокупность методов конструирования in vitro искусственных рекомбинантных молекул ДНК и введения их в живые клетки для придания организмам новых генетических свойств:

• Рестриктазы (эндонуклеазы рестрикции, открыты В. Арбером, Х. Смитом, Д. Натансом, Нобелевская премия 1978 г.) — «молекулярные ножницы», бактериальные ферменты, узнающие короткие палиндромные последовательности ДНК (сайты рестрикции) и расщепляющие двойную спираль с образованием «липких» или «тупых» концов;

• ДНК-лигазы — «молекулярный клей», ферменты, сшивающие фрагменты ДНК ковалентными фосфодиэфирными связями;

• Векторы — молекулы-переносчики генов. Чаще всего используют бактериальные плазмиды (малые кольцевые внехромосомные самореплицирующиеся ДНК бактерий) и вирусные фаги.

Классический триумф биотехнологии — промышленное производство медицинского инсулина человека бактериями кишечной палочки (Escherichia coli):

1. Выделение зрелой мРНК инсулина из клеток поджелудочной железы человека;

2. Синтез кДНК (комплементарной ДНК без интронов) с помощью фермента обратной транскриптазы (ревертазы);

3. Разрезание бактериальной плазмиды и гена инсулина одной и той же рестриктазой для формирования комплементарных «липких концов»;

4. Сшивание гена инсулина с плазмидой с помощью ДНК-лигазы с образованием рекомбинантной плазмиды;

5. Трансформация — введение рекомбинантной плазмиды в культуру бактерий E. coli;

6. Выращивание трансгенных бактерий в биореакторах-ферментерах: бактерии транслируют ген человека, синтезируя чистый человеческий инсулин без аллергенных примесей.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод экспоненциального многомиллионного амплифицирования (размножения) специфического участка ДНК in vitro. Разработан Кэри Муллисом в 1983 г. (Нобелевская премия 1993 г.).

Компоненты ПЦР-смеси:

• Исследуемая матричная ДНК (даже одна молекула из капли крови);

• Пара синтетических праймеров (короткие олигонуклеотиды, комплементарные границам участка);

• Смесь четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ);

• Термостабильная Taq-полимераза (выделена из экстремофильной бактерии горячих гейзеров Thermus aquaticus, выдерживает температуру кипения 95 °C).

Один термоцикл ПЦР (повторяется 30-40 раз в амплификаторе):

1. Денатурация (94-95 °C, 30 с) — расхождение цепей ДНК на две одиночные нити;

2. Отжиг праймеров (55-60 °C, 30 с) — комплементарная посадка праймеров на матрицу;

3. Элонгация (72 °C, 1 мин) — Taq-полимераза синтезирует новые комплементарные цепи.

За 30 циклов количество копий фрагмента возрастает в 2³⁰ раз (более миллиарда копий!).

Клеточная инженерия — конструирование новых клеток путем гибридизации, слияния и трансплантации ядер:

• Соматическая гибридизация — слияние протопластов растительных клеток разных видов без полового процесса;

• Клонирование млекопитающих методом SCNT (перенос ядра соматической клетки):

В 1996 г. в институте Рослина (Шотландия) Ян Вилмут впервые успешно клонировал взрослое млекопитающее — овечку Долли:

1. Из яйцеклетки овцы-донора удалили собственное гаплоидное ядро (энуклеация);

2. Из молочной железы взрослой овцы-донора взяли соматическую диплоидную клетку (2n);

3. С помощью микроэлектрического импульса соматическую клетку слили с безъядерной яйцеклеткой;

4. Эмбрион вырастили in vitro до стадии бластоцисты и пересадили в матку суррогатной матери;

5. Родившийся ягненок Долли был точной генетической копией овцы-донора соматического ядра.

Четкая граница методов на ЕНТ:

• ГЕННАЯ инженерия — манипуляции на уровне МОЛЕКУЛ ДНК (рестрикция, лигирование, рекомбинантные плазмиды, ПЦР, введение генов, секвенирование);

• КЛЕТОЧНАЯ инженерия — манипуляции на уровне ЦЕЛЫХ КЛЕТОК, ЯДЕР И ТКАНЕЙ (культура тканей in vitro, каллус, микроклонирование растений, слияние протопластов, клонирование животных методом пересадки ядер, гибридомы);

• Taq-полимераза термостабильна, потому что выделена из экстремофильных термофильных бактерий горячих источников.